Wewnątrzkomórkowa odwrotna transkrypcja szczepionki mRNA Pfizer BioNTech COVID-19 BNT162b2 in vitro w ludzkiej linii komórkowej wątroby

Abstrakcyjny

Badania przedkliniczne szczepionki mRNA COVID-19 BNT162b2, opracowanej przez firmy Pfizer i BioNTech, wykazały odwracalne działanie na wątrobę u zwierząt, które otrzymały zastrzyk BNT162b2. Co więcej, ostatnie badanie wykazało, że RNA SARS-CoV-2 może podlegać odwrotnej transkrypcji i integracji z genomem komórek ludzkich. W tym badaniu zbadaliśmy wpływ BNT162b2 na ludzką linię komórek wątroby Huh7 in vitro. Komórki Huh7 poddano ekspozycji na BNT162b2 i przeprowadzono ilościową reakcję PCR na RNA wyekstrahowanym z komórek. Wykryliśmy wysoki poziom BNT162b2 w komórkach Huh7 i zmiany w ekspresji genów długiego rozproszonego elementu jądrowego-1 (LINE-1), który jest endogenną odwrotną transkryptazą. Immunohistochemia wykorzystująca wiązanie przeciwciała z białkiem wiążącym RNA z otwartą ramką odczytu-1 LINE-1 (ORFp1) na komórkach Huh7 traktowanych BNT162b2 wykazała zwiększoną dystrybucję jądra LINE-1. PCR na genomowym DNA komórek Huh7 wystawionych na BNT162b2 wzmocnił sekwencję DNA unikalną dla BNT162b2. Nasze wyniki wskazują na szybkie wychwytywanie BNT162b2 przez ludzką linię komórkową wątroby Huh7, co prowadzi do zmian w ekspresji i dystrybucji LINE-1. Pokazujemy również, że mRNA BNT162b2 ulega odwrotnej transkrypcji wewnątrzkomórkowej do DNA w ciągu zaledwie 6 godzin po ekspozycji na BNT162b2.
1. Wstęp
Choroba koronawirusa 2019 (COVID-19) wywołana przez koronawirus 2 zespołu ostrej ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2) została ogłoszona przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) jako globalna pandemia w dniu 11 marca 2020 r. i okazała się niszczycielskim kryzysem zdrowotnym . Według stanu na luty 2022 r. COVID-19 doprowadził do ponad 430 milionów zgłoszonych przypadków infekcji i 5,9 miliona zgonów na całym świecie [ 1 ]. Pilnie potrzebne są skuteczne i bezpieczne szczepionki, aby zmniejszyć wskaźniki zachorowalności i śmiertelności związane z COVID-19.
Opracowano kilka szczepionek na COVID-19, ze szczególnym uwzględnieniem szczepionek mRNA (firmy Pfizer-BioNTech i Moderna), rekombinowanych szczepionek z wektorem adenowirusowym powodującym defekt replikacji (firmy Janssen-Johnson i Johnson, Astra-Zeneca, Sputnik-V i CanSino ) oraz szczepionki inaktywowane (firmy Sinopharm, Bharat Biotech i Sinovac). Szczepionka mRNA ma zalety polegające na tym, że jest elastyczna i wydajna w projektowaniu i wytwarzaniu immunogenów, a obecnie wielu kandydatów na szczepionki znajduje się na różnych etapach opracowywania i stosowania. W szczególności szczepionka COVID-19 mRNA BNT162b2 opracowana przez Pfizer i BioNTech została oceniona w udanych badaniach klinicznych [ 2 , 3 , 4 ] i podawana w krajowych kampaniach szczepień przeciwko COVID-19 w różnych regionach świata [5 , 6 , 7 , 8 ].
BNT162b2 to szczepionka RNA (modRNA) zawierająca nanocząsteczki lipidów (LNP) i modyfikowana nukleozydami, która koduje pełnej długości białko wypustek (S) SARS-CoV-2, zmodyfikowane przez dwie mutacje proliny w celu zapewnienia antygenowo optymalnej konformacji przed fuzją , który naśladuje nienaruszonego wirusa, aby wywołać przeciwciała neutralizujące wirusa [ 3 ]. Zgodnie z randomizowanymi badaniami klinicznymi, BNT162b2 wykazał wysoką skuteczność w szerokim zakresie wyników związanych z COVID-19 w warunkach rzeczywistych [ 5]. Niemniej jednak pozostaje wiele wyzwań, w tym monitorowanie długoterminowego bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki. Gwarantuje to dalszą ocenę i badania. Profil bezpieczeństwa BNT162b2 jest obecnie dostępny tylko z krótkoterminowych badań klinicznych. Zgłaszano mniej częste działania niepożądane BNT162b2, w tym zapalenie osierdzia, arytmię, zakrzepicę żył głębokich, zator płucny, zawał mięśnia sercowego, krwotok śródczaszkowy i małopłytkowość [ 4 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20]. Istnieją również badania, które donoszą o niekorzystnych skutkach obserwowanych po innych rodzajach szczepionek [ 21 , 22 , 23 , 24 ]. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw działań niepożądanych związanych ze szczepionką, potrzebne są badania kliniczne oraz analizy komórkowe i molekularne.
Ostatnie badania wykazały, że RNA SARS-CoV-2 mogą podlegać odwrotnej transkrypcji i integracji z genomem komórek ludzkich [ 25 ]. Rodzi to pytanie, czy może to również wystąpić w przypadku BNT162b2, który koduje częściowy RNA SARS-CoV-2. W danych farmakokinetycznych dostarczonych przez firmę Pfizer do Europejskiej Agencji Leków (EMA), biodystrybucję BNT162b2 badano u myszy i szczurów poprzez wstrzyknięcie domięśniowe znakowanego radioaktywnie LNP i modRNA lucyferazy. Radioaktywność wykryto w większości tkanek od pierwszego punktu czasowego (0,25 godz.), a wyniki wykazały, że miejsce wstrzyknięcia i wątroba były głównymi miejscami dystrybucji, przy czym maksymalne stężenia obserwowano 8–48 godz. po podaniu [ 26]. Ponadto u zwierząt, które otrzymały wstrzyknięcie BNT162b2, zaobserwowano odwracalne efekty wątrobowe, w tym powiększenie wątroby, wakuolizację, podwyższony poziom gamma-glutamylotransferazy (γGT) oraz podwyższony poziom transaminazy asparaginianowej (AST) i fosfatazy alkalicznej (ALP) [ 26 ]. Przejściowe działanie na wątrobę indukowane przez systemy dostarczania LNP opisano wcześniej [ 27 , 28 , 29 , 30 ], niemniej wykazano również, że pusty LNP bez samego modRNA nie powoduje żadnego istotnego uszkodzenia wątroby [ 27 ].]. Dlatego w tym badaniu zamierzamy zbadać wpływ BNT162b2 na ludzką linię komórkową wątroby in vitro i zbadać, czy BNT162b2 może podlegać odwrotnej transkrypcji do DNA poprzez mechanizmy endogenne.
Wyniki
3.1. BNT162b2 wkracza do ludzkiej linii komórkowej wątroby do komórek Huh7 z wysoką wydajnością.
3.2. Wpływ BNT162b2 na ludzki endogenny element jądrowy z odwrotną transkryptazą z długimi przerwami 1 (LINE-1).

3.3. Wykrywanie DNA BNT162b2 poddanego odwrotnej transkrypcji w komórkach Huh7

4. Dyskusja
W tym badaniu przedstawiamy dowody, że szczepionka mRNA COVID-19 BNT162b2 jest zdolna do wniknięcia do ludzkiej linii komórek wątroby Huh7 in vitro. mRNA BNT162b2 ulega odwrotnej transkrypcji wewnątrzkomórkowej do DNA już po 6 godzinach od ekspozycji na BNT162b2. Możliwym mechanizmem odwrotnej transkrypcji jest endogenna odwrotna transkryptaza LINE-1, a dystrybucja białek jądra komórkowego LINE-1 jest podwyższona przez BNT162b2.

5. Nasze badanie jest pierwszym badaniem in vitro nad wpływem szczepionki mRNA COVID-19 BNT162b2 na ludzką linię komórkową wątroby. Przedstawiamy dowody na szybkie wejście BNT162b2 do komórek, a następnie wewnątrzkomórkową odwrotną transkrypcję mRNA BNT162b2 do DNA.

Finansowanie
Badanie było wspierane przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych, Strategiczny Obszar Badań Exodiab, Dnr 2009-1039, Szwedzki Rządowy Fundusz Badań Klinicznych (ALF) oraz fundację Szpitala Uniwersyteckiego w Skanii.

Konflikt interesów
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Całość
Intracellular Reverse Transcription of Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA Vaccine BNT162b2 In Vitro in Human Liver Cell Line