Das schwere akute Atemwegssyndrom (SARS) trat 2002 in China auf und breitete sich in anderen Ländern aus, bevor es unter Kontrolle gebracht wurde. Aus Sorge um ein Wiederauftauchen oder eine absichtliche Freisetzung des SARS-Coronavirus wurde die Impfstoffentwicklung eingeleitet. Die Auswertung eines inaktivierten ganzjährigen Virusimpfstoffs bei Frettchen und nichtmenschlichen Primaten und eines virusähnlichen Partikelimpfstoffs bei Mäusen induzierten den Schutz vor Infektionen, aber die herausgeforderten Tiere zeigten eine immunpathologische Lungenerkrankung.
Design
Vier Kandidatenimpfstoffe für Menschen mit oder ohne Alumadjuvant wurden in einem Mausmodell von SARS, einem VLP-Impfstoff, dem Impfstoff für Frettchen und NHP, einem weiteren vollständigen Virusimpfstoff und einem rDNA-produzierten S-Protein bewertet. Balb/c- oder C57BL/6-Mäuse wurden am Tag 0 und 28 im IM geimpft und für Serumantikörpermessungen geopfert oder am 56. Tag mit lebenden Viren herausgefordert. Am 58. Tag wurden herausgeforderte Mäuse geopfert und Lungen für Virus und Histopathologie erhalten.
Ergebnisse
Alle Impfstoffe induzierten Serum neutralisierende Antikörper mit steigenden Dosierungen und/oder Alum deutlich erhöhende Reaktionen. Signifikante Reduktionen von SARS-CoV zwei Tage nach der Herausforderung wurde für alle Impfstoffe und vorherige live SARS-CoV gesehen. Alle Mäuse zeigten zwei Tage nach der Herausforderung histopathologische Veränderungen in der Lunge, einschließlich aller geimpften Tiere (Balb/C und C57BL/6) oder mit lebendem Virus, Grippeimpfstoff oder PBS, die auf eine Infektion in allen fällen. Die Histopathologie, die bei Tieren, die einen der SARS-CoV-Impfstoffe erhielten, beobachtet wurde, war einheitlich eine Th2-Typ-Immunpathologie mit prominenter eosinophiler Infiltration, die mit speziellen eosinophilen Flecken bestätigt wurde. Die pathologischen Veränderungen, die in allen Kontrollgruppen beobachtet wurden, fehlten die eosinophile Prominenz.
Schlussfolgerungen
Diese SARS-CoV-Impfstoffe sind alle induzierten Antikörper und Schutz vor Infektionen mit SARS-CoV. Die Herausforderung von Mäusen, die einen der Impfstoffe erhielten, führte jedoch zum Auftreten der Th2-Typ-Immunpathologie, die darauf hindeutete, dass eine Überempfindlichkeit gegen SARS-CoV-Komponenten induziert wurde. Vorsicht bei der Anwendung eines SARS-CoV-Impfstoffs beim Menschen ist angezeigt.
Zahlen
Zitat: Tseng C-T, Sbrana E, Iwata-Yoshikawa N, Newman PC, Garron T, Atmar RL, et al. (2012) Immunisierung mit SARS Coronavirus-Impfstoffen führt zur Lungenimmunpathologie auf Herausforderung mit dem SARS-Virus. PLoS ONE 7(4): e35421. journals.plos.org/…d=10.1371/journal.pone.0035421
Herausgeber: Stefan Poehlmann, Deutsches Primatenzentrum, Deutschland
Erhalten: 31. Januar 2012; Akzeptiert: 15. März 2012; Veröffentlicht: 20. April 2012
Finanzierung: Die von den Autoren durchgeführten und in diesem Bericht zusammengefassten Forschungsergebnisse wurden durch den Public Health Service Contract NO1 AI 30039 des National Institute of Allergy and Infectious Diseases unterstützt. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health and Human Services wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-Regierung. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.
Einleitung
Das schwere akute Atemwegssyndrom (SARS) trat Ende 2002 in Guangdong, Volksrepublik China, auf und breitete sich in den folgenden Monaten auf andere Länder in Asien und Kanada aus [1]–[3]. Die Infektionsbekämpfung brachte die Infektion bis Mitte 2003 unter Kontrolle [4]. Während des Ausbruchszeitraums wurden mehr als 8000 Fälle gemeldet, darunter fast 800 Todesfälle [4]. Zunehmendes Alter und Komorbidität waren Risikofaktoren für schwere Krankheiten und Tod [5], [6], [7]. Seit 2003 wurden nur sporadische Fälle gemeldet; die Möglichkeit, dass SARS-Ausbrüche auf natürliche Weise wiederauftreten oder absichtlich freigesetzt werden könnten, ist jedoch ein Problem der öffentlichen Gesundheit.
SARS wird durch ein Coronavirus (SARS-CoV) [8] , [9]verursacht. Begrenzte Daten sind verfügbar über die Ökologie von SARS-CoV, aber Fledermäuse werden angenommen, dass das Tierreservoir für das Virus, das auf kleine Säugetiere mit Exposition gegenüber diesen kleinen Tieren als Quelle menschlicher Infektionen übertragen werden kann [10]. Die klinische Erkrankung ähnelt anderen schweren akuten Atemwegsinfektionen, einschließlich Grippe; Die SARS-Falldefinition umfasst klinische, epidemiologische und Laborkriterien [11], [12]. Eine Reihe von therapeutischen Anstrengungen wurden für die Krankheit in Asien und in Kanada eingesetzt; es wurde jedoch keine Behandlung von klarem Wert festgestellt. Tiermodelle wurden mit Mäusen, Hamstern, Frettchen und nichtmenschlichen Primaten entwickelt, und die Bemühungen, nützliche Behandlungen und wirksame Impfstoffe zu identifizieren, sind im Gange.
Impfstoffkandidaten zur Vorbeugung von SARS wurden von verschiedenen Gruppen entwickelt und umfassen inaktivierte ganze Viren, Spike (S)-Proteinpräparate, virusähnliche Partikel (VLPs), Plasmid-DNA und eine Reihe von Vektoren, die Gene für SARS-CoV-Proteine enthalten [13]–[28]. Phase-I-Studien am Menschen wurden mit einem ganzen Virusimpfstoff und einem DNA-Impfstoff durchgeführt [29]–[30].
Ein frühes Anliegen für die Anwendung eines SARS-CoV-Impfstoffs war die Erfahrung mit anderen Coronavirus-Infektionen, die eine verbesserte Krankheit und Immunpathologie bei Tieren induzierten, wenn sie mit dem infektiösen Virus in Frage gestellt wurden [31],ein Anliegen, das durch den Bericht verstärkt wurde, dass Tiere, die einen Alum-adjuvanten SARS-Impfstoff erhielten und anschließend mit SARS-CoV zeigte eine immunpathologische Lungenreaktion, die an die beschriebene für das respiratorische Synzytialvirus (RSV) bei Säuglingen und in Tiermodellen erinnerte, die RSV-Impfstoff erhielten und natürlich (Kleinkinder) oder künstlich (Tiere) mit RSV [32] [32] [33]herausforderten. Wir und andere beschrieben eine ähnliche immunpathologische Reaktion bei Mäusen, die mit einem SARS-CoV-Impfstoff geimpft und anschließend mit SARS-CoV [18], [20], [21], [28]herausgefordert wurden. Es wurde vorgeschlagen, dass das Nukleocapsidprotein von SARS-CoV das Antigen ist, auf das die immunpathologische Reaktion gerichtet ist [18], [21]. Aus diesen verschiedenen Beobachtungen ergab sich daher die Sorge, mit SARS-CoV-Impfstoffen zum Menschen überzugehen.
Die hier berichteten Studien wurden durchgeführt, um die Sicherheit, Immunogenität und Wirksamkeit verschiedener SARS-CoV-Impfstoffe in einem murinen Modell von SARS zu bewerten.
Materialien und Methoden
Gewebekulturen und Viren
Vero E6 Gewebekulturen [aus der American Type Culture Collection (ATCC), CRL:1586] wurden in Dulbeccos modifiziertem minimalen essentiellen Medium (DMEM) angebaut, ergänzt durch Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 g/ml), 0,2% Natriumbicarbonat und 10% fetales Rinderserum (FBS). Der Urbani-Stamm von SARS-CoV wurde von T.G. Ksiazek an den Centers for Disease Control and Prevention (Atlanta, GA) gewonnen, und ein Arbeitsbestand dieses Virus wurde durch die serielle Weitergabe eines Teils des Samenvirus dreimal (p3) in Vero E6 Kulturen hergestellt. Die Kulturflüssigkeit aus infizierten Zellen wurde durch Eine Niedrige-Speed-Zentrifugation geklärt, durch einen 0,45-m-Filter gefiltert, aliquoted und bei 80 °C gelagert.
Impfstoffe
In diesen Studien wurden vier verschiedene SARS-CoV-Impfstoffe evaluiert (Tabelle 1). Zwei ganze Virusimpfstoffe wurden evaluiert; eine wurde in Vero-Gewebekulturen hergestellt, zonal zentrifugiert zur Reinigung und doppelt inaktiviert mit Formalin- und UV-Bestrahlung, dem DI-Impfstoff (DIV); es wurde mit und ohne Alum adjuvant getestet [16]. Der andere gesamte Virusimpfstoff wurde in Vero-Zellen hergestellt, konzentriert, gereinigt, mit Betapropiolacton inaktiviert und mit Alumadjuvant (BPV) verpackt [13]. Ein rekombinanter DNA-Spike (S)-Proteinimpfstoff (SV) wurde in Insektenzellen produziert und durch Säulenchromatographie gereinigt mit und ohne Alumadjuvant getestet [17]. Der vierte Impfstoff (der VLP-Impfstoff) war ein virusähnlicher Partikelimpfstoff, der von uns wie zuvor beschrieben hergestellt wurde; es enthielt das SARS-CoV-Spikeprotein (S) und das Nucleocapsid (N), Hüllkurve (E) und Membran (M) Proteine aus Demperamenhepatitis-Coronavirus (MHV) [20].
Sechs- bis acht Wochen alte, weibliche Balb/c- und C57BL/6-Mäuse (Charles River Laboratory, Wilmington, MA) wurden in Käfigen untergebracht, die mit Barrierefiltern bedeckt waren, in einer zugelassenen Tieranlage der Biosicherheitsstufe 3, die von der University of Texas Medical Branch (UTMB) in Galveston, Texas, unterhalten wurde. Alle Experimente wurden mit experimentellen Protokollen durchgeführt, die vom Office of Research Project Protections, Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), University of Texas Medical Branch genehmigt wurden und den Richtlinien der National Institutes of Health und des UNITED States Department of Agriculture folgten.
Studiendesign
Drei verschiedene Experimente, die zum Vergleich verschiedener Impfstoffe durchgeführt wurden, werden hier berichtet. Adjuvante (Alum) und nicht adjuvante (PBS) Impfstoffe wurden aus der NIH/BEI-Ressource gewonnen. Gruppen von Mäusen (N = 12-13 pro Gruppe) wurden verschiedene Dosierungen jedes Impfstoffs intramuskulär (IM) an den Tagen 0 und 28 verabreicht; Mäuse, die nur PBS, Alum, dreiwertigen inaktivierten Grippeimpfstoff oder lebende SARS-CoV erhielten, wurden als Kontrollen in verschiedene Experimente einbezogen. Am 56. Tag wurden fünf Mäuse aus jeder Gruppe für die Beurteilung der Serumneutralisation von Antikörpertittern und der Lungenhistopathologie geopfert; die übrigen sieben oder acht Mäuse in jeder Gruppe wurden mit 106TCID50/60 l SARS-CoV intranasal (IN). Herausgeforderte Mäuse wurden am 58. Tag eingeschläfert, um die Virusmenge zu bestimmen und Lungengewebeabschnitte für die histopathologische Untersuchung vorzubereiten.
Neutralisierende Antikörper-Assays
Mäuse wurden mit Isofluran befruchtet und dann aus dem retroorbitalen Sinusplexus geblutet. Nach der Inaktivierung der Wärme bei 56 °C für 30 Minuten wurden die Seren bis zur Prüfung bei 80 °C gelagert. Es wurden Tests auf virusspezifische neutralisierende Antikörper an seriellen 2-fach verdünnten Proben jedes Serums mit 2% FBS-DMEM als Verdünnungsmittel in 96-Well-Gewebekulturplatten (Falcon 3072) durchgeführt. das Endvolumen der seriell verdünnten Proben in jedem Bohrstand betrug 60 l nach Zugabe von 120 TCID50 SARS-CoV in 60 l in jeden Brunnen. Die anfangsverdünnung des Serums betrug 1∶20. Die Verdünnungen wurden für 45-60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert; dann wurden 100 l jedes Gemischs in doppelte Brunnen von konfluenten Vero E6-Zellen in 96-Well-Mikrotiterplatten übertragen. Nach 72 Stunden Inkubation, als die Viruskontrollbrunnen fortschrittliche virusinduzierte CPE aufwiesen, wurde die Neutralisierungskapazität einzelner Serumproben durch Die Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens einer zytopathischen Wirkung (CPE) beurteilt. Neutralisierende Antikörpertiter wurden als Dieke der letzten Verdünnung des Serums ausgedrückt, die das virusinduzierte CPE vollständig hemmte.
Sammlung und Verarbeitung von Lungen für Histologie und Virusmenge
Zwei Tage nach der SARS-CoV-Herausforderung wurden Mäuse eingeschläfert und ihre Lunge entfernt. Lungenlappen wurden in 10% neutral gepuffertes Formalin für die histologische Untersuchung und Immunhistochemie (IHC) gelegt, wie zuvor beschrieben [34], [35]. Bei der Virusquantifizierung wurde die verbleibende Gewebeprobe gewogen und auf 80 °C eingefroren. Die aufgetaute Lunge wurde in PBS/10% FBS-Lösung mit dem TissueLyser (Qiagen; Retsch, Haan, Deutschland). Die Homogenate wurden zentrifugiert und SARS-CoV-Titer in den geklärten Flüssigkeiten wurden durch serielle Verdünnung in Viererbrunnen von Vero E6-Zellen in 96-Well-Platten bestimmt. Titers von Virus in Lungenhomogenaten wurden als TCID exprimiert50/g der Lunge (log10); Der minimale nachweisbare Viruspegel betrug 1,6 bis 2,6 Log10 TCID50 durch die Lungengröße bestimmt.
Histopathologie
Bewertungen für die Histopathologie wurden von Pathologen durchgeführt, die über den Impfstoff/die Dosierung jeder Probenquelle maskiert waren; numerische Werte wurden zugewiesen, um das Ausmaß der pathologischen Schäden und die eosinophile Komponente der entzündlichen Infiltrate zu bewerten.
Statistische Analyse
Neutralisierende Antikörpertiter, Lungenvirus-Titer, histopathologischer Läsionsscore und eosinophile Infiltrationswerte wurden für jede Gruppe von Mäusen gemittelt. Die Vergleiche wurden mit parametrischen und nichtparametrischen Statistiken durchgeführt, wie angegeben.
Ergebnisse
Experimente
Die drei durchgeführten Experimente, Impfstoffe und Dosierungen sowie Die Kontrollen für jedes Experiment sind in Tabelle 1dargestellt. Die Impfstoffe wurden auf Immunogenität und Wirksamkeit untersucht; Aufgrund des vorherigen Berichts über die Immunpathologie über die Herausforderung von Frettchen und nichtmenschlichen Primaten, die mit einem ganzen Virus-Adjuvans-Impfstoff geimpft worden waren, und Mäusen, die mit einem VLP-Impfstoff geimpft worden waren, bestand die primäre Ausrichtung jedoch darin, die Immunpathologie bei Tieren in Bezug auf die Art des Impfstoffs, die Dosierung, die Serum-Antikörperreaktionen und die Virusinfektion zu bewerten. Die Impfstoffpräparate wurden für Studien am Menschen hergestellt, so dass die Identifizierung eines Präparats, das beim Menschen wahrscheinlich sowohl sicher als auch schützend ist, erwünscht war. Die Gründe für jedes Experiment werden beschrieben.
Vergleich von Impfstoffen (Experiment 1).
Zur Unterscheidung zwischen Impfstoffen wurden drei Impfstoffpräparate gleichzeitig evaluiert, der doppelt inaktivierte (Formalin und UV) ganze Virusimpfstoff (DIV), der rDNA-exprimierte S-Protein-Impfstoff (SV) und der zuvor evaluierte chimäre virale Partikelimpfstoff (VLP), der zu einer Immunpathologie mit Virusherausforderung geführt hatte [16], [17], [20].
Geometrische mittlere Serum neutralisierende Antikörpertiter für jede Gruppe an Tag 56 sind in Abbildung 1Adargestellt. Geometrische Mitteltier für diejenigen, die einen nonadjuvanted oder Alum adjuvanted Impfstoff erhielten, unterschieden sich nicht für den doppelt inaktivierten ganzen Virusimpfstoff (DIV) und den VLP-Impfstoff (p>0,05, Studenten-T-Test), waren aber für den S-Protein-Impfstoff (SV) unterschiedlich (p = 0,001, Schüler-t-Test). Geometrische Mitteltiter für die verschiedenen Dosierungsgruppen, die den DI-Impfstoff (DIV) mit Alum und die für die Gruppen mit dem S-Protein-Impfstoff (SV) mit oder ohne Alum erhielten, waren signifikant unterschiedlich (p = 0,007, p = 0,028 bzw. p = 0,01, Kruskall-Wallis), während die geometrischen Mittel für die Dosierungsgruppen, die den DI-Impfstoff (DIV) ohne Alum erhielten, nicht waren (p>0,05, Kruskall-Wallis). In einer Mehrfach-Regressionsanalyse wurden die Titter für den DI-Impfstoff (DIV) sowohl um Alum als auch durch höhere Dosierung signifikant erhöht (für Alum, p = 0,012, für Dosierung, p <0,001); für den S-Protein-Impfstoff (SV) nur Alum erhöhte Reaktionen (p = 0,001).
Abbildung 1. Impfstoffvergleiche von drei SARS-CoV-Impfstoffen, Experiment 1.
Serumneutralisierende (neut) Antikörper- und Lungenvirus-Titter für jede Impfstoff-Dosierungsgruppe. A. Geometrischer mittlerer Serumantikörper-Titer als Log2 und Standardfehler des Mittelwerts (S.E.) an Tag 56 für jede Impfstoffdosierungsgruppe. Sieben bis acht Mäuse pro Gruppe. Impfstoffe: doppelt inaktiviertes ganzes Virus (DIV), rekombinantes S-Protein (SV), viral-ähnlicher Partikelimpfstoff (VLP), mit Alum (+A). Fünf Mäuse pro Gruppe erhielten an den Tagen 0 und 28 0,1 ml Impfstoff intramuskulär. B. Geometrischer mittlerer Virustiter (Log10 TCID50/g) und Standardfehler des Mittelwerts (S.E.) in der Lunge am Tag 58 (zwei Tage nach SARS-CoV-Herausforderung) für jede Impfstoffdosierungsgruppe. Analysen: A. GMT mit ohne Alum: DIV p>.05, VLP p>.05, SV p = .001. GMT für unterschiedliche Impfstoffdosierung: DIV mit Alum p = .007, DIV ohne Alum p>.05, SV mit Alum p = .028, SV ohne Alum p = 0,01. Multiple Regression: GMT erhöht für Alum p = 0,012 und Dosierung p<.001, für SV Alum nur p = .001. B. GMT für alle DIV-Gruppen nicht unterschiedlich p>.05, GMT für SV-Gruppe ohne Alum p .008 und mit Alum p .023. GMT für VLP-Gruppe unterscheidet sich nicht p>.05.
Zwei Tage nach der Herausforderung wurden von allen Tieren Lungen für Virusquantitation und Histologie gewonnen. CoV-Titer sind in Abbildung 1Bdargestellt. Geometrische mittlere Lungentitter in den Alum- und PBS-Kontrollgruppen waren 107.3 und 106.3 TCID50/g. Alle Impfgruppen wiesen am zweiten Tag nach der Herausforderung niedrigere Titer oder kein nachweisbares Virus auf. Keines der Tiere, die eine der alum-adjuvanted DI-Impfstoff (DIV) Dosierungen und nur gelegentliches Tier in den niedrigeren Dosierungen des nonadjuvanted Impfstoffs ergab Virus (Kruskall-Wallis und Mann Whitney U Tests, p>0.05 für alle Vergleiche). Alle Gruppen, die den S-Protein-Impfstoff (SV) erhielten, lieferten nach einer Herausforderung ein Virus, und die Unterschiede zwischen den Gruppen waren signifikant (p = 0,002 für alle Gruppen, p = 0,023 für Alum und p = 0,008 für kein Adjuvans, Kruskall-Wallis); auch, geometrische mittlere Titer waren höher für die Gruppen, die niedrigere Impfstoffdosierungen gegeben. Die geometrischen mittleren Titer für die VLP-Impfstoffgruppen waren ähnlich (p>0.05).
Im Impfstoffvergleichsexperiment wurden Lungenläsionswerte für die Histopathologie für einzelne Tiere auf einer Skala von 0 bis 4 eingestuft, wobei 0–2 den Grad der zellulären Infiltration darstellten und 3–4 den Grad der Bronchiolarepithelzellnekrose und des Zellmülls der Atemwege darstellten(Abbildung 2A). Wie gezeigt, zeigten alle Tiere pathologische Veränderungen nach Herausforderung, einschließlich der Tiere ohne messbares Virus am zweiten Tag, was darauf hindeutet, dass eine Virusinfektion aufgetreten war, aber am zweiten Tag wegen einer kurzen Dauer der Infektion oder Neutralisierung des Virus durch Antikörper in der Lunge während der Verarbeitung nicht nachweisbar war. Die höheren Werte (>3) in einigen Gruppen bezogen sich in erster Linie auf die Tatsache, dass Virusinfektionen entzündliche Infiltrate und Epithelzellnekrose mit Desquamation des Epithels und Sammlung von Zellablagerungen in den Atemwegen dieser Tiere induziert hatten. Zwischen den verschiedenen Impfstoffen wurden mittlere Score-Unterschiede festgestellt (p = <0.001, Anova). Die Gruppen, die den DI-Impfstoff (DIV) ohne Alum erhielten, wiesen höhere Mittlere Werte auf als diejenigen, die DI-Impfstoff (DIV) mit Alum erhielten (p = 0,001, Mann-Whitney U); in ähnlicher Weise hatte die Gruppe, die den VLP-Impfstoff ohne Alum erhielt, einen höheren Mittelwert als für die mit dem VLP-Impfstoff mit Alum verabreichten Personen (p = 0,008, Mann-Whitney U). Post-hoc-Vergleiche für die drei verschiedenen Impfstoffe zeigten, dass die DI-Impfstoffgruppe (DIV) insgesamt niedrigere Läsionswerte aufwies als die Gruppe S-Protein-Impfstoff (SV) oder die Alum- und PBS-Kontrollgruppen (p = 0,001 im Vergleich der DI- und S-Proteinimpfstoffe (DIV und SV) und p<0,001 für DIV vs. Tukey HSD bzw. Dunnett t), jedoch nicht die VLP-Impfstoffgruppe (p>0.05, Tukey HSD). Die S-Protein-Impfstoffgruppe (SV) war ebenfalls insgesamt niedriger als die Kontrollgruppen (p = 0,048, Dunnett t).
Abbildung 2. Impfstoffvergleiche von drei SARS-CoV-Impfstoffen, Experiment 1.
Mittlere Lungenzellinfiltration/Läsionspathologie und prozentige Eosinophile in Infiltraten für jede Impfstoff-Dosierungsgruppe zwei Tage nach der Herausforderung mit SARS-CoV. A. Mittlerer Läsionswert und Standardfehler des Mittelwerts (S.E.) für jede Impfstoffdosierungsgruppe. Alle Mäuse zeigten Lungenhistopathologie. Die Werte sind mittelwert für sieben bis acht Mäuse pro Gruppe. Scoring. 0 – keine Pathologie, 1 und 2 – (1) minimal (2) moderate peribronchiolische und perivaskuläre zelluläre Infiltration, 3 und 4 – 1 und/oder 2 plus minimale (3) oder moderate (4) Epithelzellnekrose von Bronchiolen mit Zellablagerungen im Lumen. B. Durchschnittliche Prozenteosinophile bei histologischer Bewertung für sieben bis acht Mäuse in jeder Impfstoff-Dosierungsgruppe. Mittelwert für jede Maus ist der mittlere Prozenteosinophile auf fünf separaten Mikroskopiefeldern von Lungenabschnitten. Analysen: A. Mittlere Läsionswerte waren unterschiedlich p<.001. DIV ohne Alum größer als mit Alum p = .001, VLP ohne Alum größer als mit Alum p = .008. Posthoc-Vergleiche: DIV niedriger als SV p = .001 und steuert p<.001, aber nicht VLP p>.05. SV niedriger als Diebe p .048. B. Durchschnittliche Prozenteinophile waren unterschiedlich p<.001. Mittlere Prozent eosinophile niedriger für DIV mit Alum als ohne Alum p = 0,049 und niedriger für SV mit Alum als ohne Alum p = .001. Durchschnittliche Prozenteosinophile niedriger für SV als DIV p = .002 oder VLP. P = <.001. Durchschnittliche Prozenteinophile, die für DIV, SV und VLP, alle drei Impfstoffe p<.001, größer sind als die Kontrollen.
Beim Vergleich der Merkmale der Infiltrate zeigten Tiere, die Alum oder PBS erhielten, epitheliale Zellnekrose und peribronchiolare und perivaskuläre mononukleäre Zellinfiltrate, die mit einer Epithelzellinfektion und einer entzündlichen Reaktion bei Virusinfektionen übereinstimmen. Zusätzlich zu den mononukleären Zellen enthielten infiltrierte unter geimpften Tieren jedoch Neutrophile und Eosinophile, die bei den Läsionen der Tiere, die zuvor nur PBS oder Alum erhalten hatten, nicht gesehen wurden(Abbildung 2B), was auf eine Überempfindlichkeitsreaktion der T-Helferzelle Typ 2 hindeutet; erhöhte Eosinophile sind ein Marker für eine Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ Th2. Prozent eosinophile war bei diesen geimpften Tieren niedriger (Mittelwert 1–3,2%) als in der früheren Studie bei Tieren mit VLP-Impfstoffen beobachtet worden war (Mittelwert 13,2±9,6 % und 22±9,9 % der Zellen für VLP mit PBS bzw. Alum), aber keine (0%) Eosinophile wurden in diesem Experiment in der Lunge infiltriert von Kontrolltieren beobachtet. Dieses Muster von überschüssigen Eosinophilen in zellulären Infiltraten, die in Lungenabschnitten von Tieren beobachtet wurden, die Impfstoff enden und keine kontrollierbaren Tiere hatten, wurde in der früheren Studie mit VLP-Impfstoff und später mit anderen Impfstoffen gesehen, obwohl der Prozentsatz der Eosinophile in dieser Studie niedriger war.
Die durchschnittlichen Prozenteinophile unterschieden sich je nach Gruppe (p<0.001, Anova). Insgesamt war der Prozentsatz für die Gruppen, die die DI- und S-Protein-Alum-Adjuvans-Impfstoffe erhielten, niedriger als für die entsprechende nonadjuvanted-Gruppe (p = 0,049 für DIV und 0,001 für SV, Mann-Whitney U). Bei den Impfstoffen waren die eosinophilen Mittelprozentsätze für den S-Protein-Impfstoff (SV) niedriger als für den DI-Impfstoff (DIV) oder den VLP-Impfstoff (DIV vs. SV, p = 0,002; VLP vs. SV, p = <0.001, Tukey HSD). Darüber hinaus waren die Eosinophilen prozentual für alle drei Impfstoffe, einschließlich des S-Protein-Impfstoffs, signifikant höher als die Kontrollen (SV-, DIV- und VLP-Impfstoff, p<0,001 für jeden Impfstoff, Tukey HSD).
Höhere Dosierungen des S Protein Vaccine Plus der bp Inactivated Whole Virus Vaccine, Experiment 2.
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Ergebnisse im ersten Experiment einer überempfindlichkeitsimmunpathologischen Reaktion nach SARS-CoV-Herausforderung von geimpften Tieren zu verifizieren, um festzustellen, ob eine höhere Dosierung des S-Protein-Impfstoffs (SV) eine Infektion unterdrücken und dennoch eine ähnliche Reaktion zeigen würde, und ob die ursprüngliche β Propiolacton inaktivierten ganzen Virusimpfstoff (BPV), der eine immunpathologische Reaktion nach einer Herausforderung von geimpften Frettchen und nichtmenschlichen Primaten gezeigt hatte, eine ähnliche immunpathologische Reaktion im Mausmodell aufwies [13], [14]. Zusätzlich wurde in diesem Experiment eine "Impfgruppe" des lebenden Virus hinzugefügt, um die Challenge-Ergebnisse nach Impfungen mit inaktivierten Impfstoffen mit denen nach einer früheren Infektion zu vergleichen.
Serumneutralisierende Antikörperreaktionen sind in Abbildung 3Adargestellt. Der bp-inaktivierte Impfstoff (BPV) war nur in einer Dosierung mit Alum erhältlich, so dass einer Gruppe ein kleineres Volumen (25 l) für einen Dosierungsvergleich verabreicht wurde. Geometrische Mitteltiter für die Gruppen, die die Alum-adjuvante Version des DI und die S-Protein-Impfstoffe erhielten, waren größer als für den nichtadjuvanted Impfstoff (DIV P = 0,014, SV p<0,001, Schüler-t-Test). In der Multiple-Regressions-Analyse wurden die Titer auch nach den DI- und S-Protein-Impfstoffen mit Alum (p≤0.01) signifikant erhöht. es wurde keine Dosierungswirkung festgestellt. Die geometrischen mittelneutralisierenden Antikörpertiter der beiden bp-inaktivierten Impfstoffgruppen (BPV) waren unterschiedlich (p = 0,039, Mann-Whitney U).
Abbildung 3. Höhere Dosierungen von SV-Impfstoff plus DIV und BPV-Impfstoffvergleiche, Experiment 2.
Serum neutralizing (neut) antibody and lung virus titers for each vaccine dosage group. A. Geometric mean serum antibody titer and standard error of the mean (S.E.) on day 56 for each vaccine dosage group. Five mice per group given 0.1 ml of vaccine intramuscularly on days 0 and 28. B. Geometric mean virus titer (log10 TCID50/g) and standard error of the mean (S.E.) in lungs on day 58 (two days after SARS-CoV challenge) for each vaccine dosage group. Seven to eight mice per group. Vaccines: double inactivated whole virus (DIV), recombinant S protein (SV), β propiolactone inactivated whole virus (BPV) with alum (+A). Analyses: A. GMT with alum greater than without alum: SV p<.001, DIV p = .014. GMT for the two BPV groups are different p = .039. Multiple regression: DIV and SV increased with alum p≤.01, no dosage effect p>.05.
Two days after challenge with 106 TCID50 of SARS-CoV, titers in mice given PBS varied between 107.0 and 108.0 TCID50 per g of tissue; one vaccinated animal in the group given the S protein vaccine (SV) at the 3 µg and the 1 µg dosage without alum yielded virus but all other animals in all other groups were culture negative for virus (figure 3B).
Shown in figure 4A are the mean lesion scores on histologic evaluations. The scoring system for experiments two and three were developed by a replacement pathologist who preferred a scale of 0 to 3 which corresponded to a judgment of mild, moderate or severe (figure 4A). Mean lesion scores for this grading system overall were significantly different from each other (p<0.001, Anova) and scores were lower for the S protein vaccine than for either of the whole virus vaccines (SV versus DIV and BPV, p<0.001 and p = 0.006, respectively, Tukey HSD). Of interest is that those given live virus and then challenged with live virus two months later exhibited an infiltrative disease severity comparable to the PBS and vaccinated groups despite no detectable virus on day two, again suggesting some degree of infection may have occurred earlier.
Figure 4. Higher Dosages of SV Vaccine plus DIV and BPV Vaccine Comparisons, Experiment 2.
Mean lung cellular infiltration/lesion pathology and mean percent eosinophils in infiltrates for each vaccine dosage group two days after challenge with SARS-CoV. A. Mean lesion score and standard error of the mean (S.E.) for each vaccine dosage group. Scores are mean of scores for seven to eight mice per group. Scoring - 0 - no definite pathology, 1 - mild peribronchiole and perivascular cellular infiltration, 2 - moderate peribronchiole and perivascular cellular infiltration, 3 - severe peribronchiolar and perivascular cellular infiltration with thickening of alveolar walls, alveolar infiltration and bronchiole epithelial cell necrosis and debris in the lumen. Ten to 20 microscopy fields were scored for each mouse lung. B. Mean score and standard error of the mean (S.E.) for eosinophils as percent of infiltrating cells for each vaccine dosage group. Scores are mean of scores for seven to eight mice per group. Scoring: 0 - <5% of cells, 1 - 5–10% of cells, 2 - 10–20% of cells, 3 - >20% of cells. Ten to 20 microscopy fields were scored for each mouse lung. Analyses: A. Mean lesion scores were different p<.001. Mean scores were lower for SV than DIV p<.001 and less than BPV p = .006. B. Mean eosinophil scores were lower for SV than DIV p<.001 and less than BPV p<.001. Eosinophil scores greater for SV than PBS or live virus p<.001.
The mean eosinophil scores for the lung infiltrations were lower for the S protein vaccine groups [SV vs. DIV p<0.001; SV vs. BPV, p<0.001, Tukey HSD]; however, they were clearly greater than seen in those given PBS or live virus earlier (p<0.001, Tukey HSD) (figure 4B).
Representative photo micrographs of lung sections from mice in this experiment two days after challenge with SARS-CoV are shown in figure 5. The pathologic changes were extensive and similar in all challenged groups (H & E stains). Perivascular and peribronchial inflammatory infiltrates were observed in most fields along with desquamation of the bronchial epithelium, collections of edema fluid, sloughed epithelial cells, inflammatory cells and cellular debris in the bronchial lumen. Large macrophages and swollen epithelial cells were seen near lobar and segmental bronchi, small bronchioles and alveolar ducts. Necrotizing vasculitis was prominent in medium and large blood vessels, involving vascular endothelial cells as well as the tunica media, and included lymphocytes, neutrophils, and eosinophils in cellular collections. Occasional multinucleated giant cells were also seen. The eosinophil component of infiltrates was very prominent in animals vaccinated with the experimental vaccine preparations when compared to animals mock-vaccinated using PBS, or those exposed earlier to live virus (figure 6); few to no eosinophils were seen in those lung sections. Thus, while pathology was seen in sections from the control mice, the hypersensitivity-type pathologic reaction with eosinophils was not seen. The morphological identification of eosinophils in H&E stains was supported by using Giemsa stain to highlight intracytoplasmic granules in selected lung sections (not shown), and confirmed by immunostaining with antibodies against mouse eosinophil major basic protein (provided by the Lee Laboratory, Mayo Clinic, Arizona) [36].
Representative photomicrographs of lung tissue two days after challenge of Balb/c mice with SARS-CoV that had previously been given a SARS-CoV vaccine. Lung sections were separately stained with hematoxylin and eosin (H&E) and an immunohistochemical protocol using an eosinophil-specific staining procedure with a monoclonal antibody to a major basic protein of eosinophils. DAB chromogen provided the brown eosinophil identity stain. The procedure and antibody were kindly provided by the Lee Laboratory, Mayo Clinic, Arizona. The H&E stain column is on the left and eosinophil-specific major basic protein (EOS MBP) stain column is on the right. Vaccines: double inactivated whole virus (DIV), β propiolactone inactivated whole virus vaccine (BPV). As shown in the images, eosinophils are prominent (brown DAB staining) in all sections examined. Exposure to SARS-CoV is associated with prominent inflammatory infiltrates characterized by a predominant eosinophilic component.
Representative photomicrographs of lung tissue from unvaccinated unchallenged mice (normal) and from Balb/c mice two days after challenge with SARS-CoV that had previously been given PBS only (no vaccine) or live virus. H&E and immunohistochemical stains for eosinophil major basic protein were performed as described for figure 5. The H&E column is on the left and the Eos MBP column is on the right. Shown are sections from normal mice (no vaccine or live virus) and mice given PBS (no vaccine) or live SARS-CoV and then challenged with SARS-CoV. As shown in the middle and bottom row images, although exposure to SARS-CoV elicits inflammatory infiltrates and accumulation of debris in the bronchial lumen, eosinophils in all groups remain within normal limits.
The different groups of vaccinated animals showed similar trends in severity of pathology and of eosinophils in inflammatory infiltrates; however, the DIV and BPV preparations at high dosage tended to produce a greater infiltration with eosinophils.
Mouse and Vaccine Specificity (Experiment 3).
Experiment 3 was performed to evaluate vaccine and mouse strain specificity. SARS-CoV vaccines used were the DI vaccine (DIV) with and without alum and the bp inactivated vaccine (BPV), which contains alum, at the highest dosage. For mouse strain specificity, Balb/c mice were included for consistency between experiments; C57BL/6 mice were given the same vaccines and dosages as Balb/c mice for comparison as C57BL/6 mice do not exhibit a bias for Th2 immunologic responses as do Balb/c mice [37]–[39]. PBS and live virus controls were again included and trivalent 2010-11 formulation influenza vaccine at a dosage of 12 µg per component was given to assess vaccine specificity.
Neutralizing antibody titers are shown in figure 7A. Geometric mean titers for the highest dose of the DI vaccine were higher for those vaccine groups in the Balb/c mice than the C57BL/6 mice but only the nonadjuvanted DI vaccine group was significantly higher (p = 0.008, Mann Whitney U). The serum antibody responses after BPV and live virus administration were similar for the two mouse strains. After challenge, mean lung virus titers were similar for the PBS control challenged mice of both mouse strains (106.7–7.3 TCID50/g lung) (figure 7B). None of the Balb/c mouse groups given either vaccine or live virus earlier yielded virus after challenge but some virus was detected in C57BL/6 mice given the DIV without alum and the BPV with alum (C57BL/6 versus Balb/c, p = 0.004, Mann Whitney U).
Figure 7. Mouse and Vaccine Specificity, Experiment 3.
Serum neutralizing (neut) antibody and lung virus titers for each vaccine dosage group. A. Geometric mean serum antibody titer and standard error of the mean (S.E.) on day 56 for each vaccine dosage group for each mouse strain (Balb/c or C57BL/6). Five mice per group given 0.1 ml of vaccine intramuscularly on days 0 and 28. B. Geometric mean virus titer (log10 TCID50/g) and standard error of the mean (S.E.) in lungs on day 58 (two days after SARS-CoV challenge for each vaccine dosage group for each mouse strain. Seven to eight mice per group. Vaccines: Double inactivated whole virus, (DIV), β propiolactone inactivated whole virus (BPV), with alum (+A). Analyses: A. GMT for highest DIV dosage without alum greater for Balb/c than C57BL/6 p = .008 but not for alum p>.05. GMT for the BPV vaccine and live virus were not different for the two strains p>.05. B. GMT for PBS control mice were not different p>.05. GMT for DIV without alum and BPV with alum greater for C57BL/6 than Balb/c p = .004.
Mean lung lesion scores two days after challenge were similar for all groups and indicated a moderate to severe degree of cellular infiltration (p>0.05 for each, Anova) (figure 8A). However, eosinophil scores were significantly different between groups (p<0.001, Anova) with significantly lower scores for nonvaccine groups than for vaccine groups of both mouse strains (p<0.001 for all comparable group comparisons, Tukey's HSD). Eosinophil scores for the vaccine groups were not different between the two mouse strains (p>0.05, t test) (figure 8B). Photomicrographs of the different vaccine and mouse strain groups are shown in figure 9. Both vaccines in both mouse strains exhibited significant cellular infiltrations that included numerous eosinophils as shown in the MBP stained sections, a finding consistent with a hypersensitivity component of the pathology. Prior influenza vaccine did not lead to an eosinophil infiltration in the lung lesions after challenge.
Figure 8. Mouse and Vaccine Specificity, Experiment 3.
Mean lung cellular infiltration/lesion pathology and percent eosinophils in infiltrates for each vaccine dosage group for each mouse strain (Balb/c or C57BL/6) two days after challenge with SARS-CoV. A. Mean lesion score and standard error of the mean (S.E.) for each vaccine dosage group. Scores are mean of scores for seven to eight mice per group. Scoring 0 - no definite pathology, 1 - mild peribronchiole and perivascular cellular infiltration, 2 - moderate peribronchiole and perivascular cellular infiltration, 3 - severe peribronchiole and perivascular cellular infiltration with thickening of alveolar walls, alveolar infiltration and bronchiole epithelial cell necrosis and debris in the lumen. Ten to 20 microscopy fields were scored for each mouse lung. B. Mean score and standard error of the mean (S.E.) for eosinophils as percent of infiltrating cells for each vaccine dosage group. Scores are mean of scores for seven to eight mice per group. Scoring: 0 - <5% of cells, 1 - 5–10% of cells, 2 - 10–20% of cells, 3 - >20% of cells. Ten to 20 microscopy fields were scored for each mouse lung. Analyses: A. Mean lesion scores were not different p>.05. B. Mean eosinophil scores were different p<.001. Mean scores for vaccine groups greater than non-vaccine groups for Balb/c and C57BL/6 p<.001 for all comparisons. Mean eosinophil scores for the same groups not different for Balb/c and C57BL/6 p>.05.
Representative photomicrographs of lung tissue two days after challenge of Balb/c and C57BL/6 mice that had previously been given a SARS-CoV vaccine. Lung sections were separately stained with H&E (pink and blue micrographs) or the immunohistochemical stain for eosinophil major basic protein (blue and brown micrographs). Balb/c mice lung sections are in the left column and C57BL/6 are in the right column; doubly inactivated whole virus vaccine is in the upper four panels and those from mice given the β propiolactone inactivated whole virus vaccine are in the lower four panels. Pathologic changes observed (inflammatory infiltrates) are similar in Balb/c and C57BL/6 and eosinophils are prominent in both groups.
The emergence of the disease SARS and the rapid identification of its severity and high risk for death prompted a rapid mobilization for control at the major sites of occurrence and at the international level. Part of this response was for development of vaccines for potential use in control, a potential facilitated by the rapid identification of the causative agent, a new coronavirus [8]–[9]. Applying the principles of infection control brought the epidemic under control but a concern for reemergence naturally or a deliberate release supported continuation of a vaccine development effort so as to have the knowledge and capability necessary for preparing and using an effective vaccine should a need arise. For this purpose, the National Institute of Allergy and Infectious Diseases supported preparation of vaccines for evaluation for potential use in humans. This effort was hampered by the occurrence in the initial preclinical trial of an immunopathogenic-type lung disease among ferrets and Cynomolgus monkeys given a whole virus vaccine adjuvanted with alum and challenged with infectious SARS-CoV [14]. That lung disease exhibited the characteristics of a Th2-type immunopathology with eosinophils in the lung sections suggesting hypersensitivity that was reminiscent of the descriptions of the Th2-type immunopathologic reaction in young children given an inactivated RSV vaccine and subsequently infected with naturally-occurring RSV [32]–[33]. Most of these children experienced severe disease with infection that led to a high frequency of hospitalizations; two children died from the infection [33], [40], [41]. The conclusion from that experience was clear; RSV lung disease was enhanced by the prior vaccination. Subsequent studies in animal models that are thought to mimic the human experience indicate RSV inactivated vaccine induces an increased CD4 T lymphocyte response, primarily of Th2 cells and the occurrence of immune complex depositions in lung tissues [32], [42], [43]. This type of tissue response is associated with an increase in type 2 cytokines including IL4, IL5, and IL13 and an influx of eosinophils into the infected lung; [32], [33], [42], [44]. Histologic sections of tissues exhibiting this type of response have a notable eosinophilic component in the cellular infiltrates. Recent studies indicate that the Th2-type immune response has both innate and adaptive immune response components [33], [43].+
In addition to the RSV experience, concern for an inappropriate response among persons vaccinated with a SARS-CoV vaccine emanated from experiences with coronavirus infections and disease in animals that included enhanced disease among infected animals vaccinated earlier with a coronavirus vaccine [31]. Feline infectious peritonitis coronavirus (FIPV) is a well-known example of antibody-mediated enhanced uptake of virus in macrophages that disseminate and increase virus quantities that lead to enhanced disease [31], [45]. Antigen-antibody complex formation with complement activation can also occur in that infection and some other coronavirus infections in animals. Thus, concern for safety of administering SARS-CoV vaccines to humans became an early concern in vaccine development.
As a site proposed for testing vaccines in humans, we requested and were given approval for evaluating different vaccine candidates for safety and effectiveness. Two whole coronavirus vaccines, one rDNA-expressed S protein vaccine and a VLP vaccine prepared by us were evaluated in a Balb/c mouse model, initially described by others, of SARS-CoV [46], [47]. The concern for an occurrence of lung immunopathology on challenge of mice vaccinated with an inactivated virus vaccine, as reported by Haagmans, et al. for ferrets and nonhuman primates, was seen by us after challenge of mice vaccinated with a SARS VLP vaccine [20]. This finding was duplicated in an experiment reported here and was also seen in mice vaccinated with a range of dosages of a double-inactivated whole virus vaccine (DIV) and an rDNA S protein vaccine (SV) although the immunopathologic reaction appeared reduced among animals given the S protein vaccine when compared to those given the whole virus vaccine. In later experiments, these findings were confirmed and the vaccine utilized by Haagmans, et al. was also shown to induce the immunopathology in mice. Thus, all four vaccines evaluated induced the immunopathology; however, all four also induced neutralizing antibody and protection against infection when compared to control challenged animals.
The immunopathology in all experiments in the present study occurred in the absence of detectable virus in lungs of mice two days after challenge with infectious virus. In two experiments, a live virus group subsequently challenged with live virus was included. These challenged animals also exhibited similar histopathologic changes after challenge although no infectious virus was detected in lungs on day two; however, in the latter case, the infiltrates were nearly 100% monocytes and lymphocytes without the eosinophil component seen in the vaccinated challenged animals. In a separate test to assess the effects of the challenge inoculum, mice were given an IN challenge with 108TCID50 of inactivated whole SARS-CoV. Lungs of these animals revealed minimal or no histopathologic damage (data not shown). These findings suggest that virus replication probably occurred early after challenge, including in animals given live CoV earlier, and is required for development of pathology, including for the immunopathology. Infection would have been transient, below the limit of detection two days after challenge, or neutralized in lung homogenates before testing for virus.. Nevertheless, the Th2-type immunopathology pattern was seen only in animals given an inactivated vaccine earlier.
During the course of these experiments, a report appeared describing a similar immunopathologic-type reaction with prominent eosinophils in SARS-CoV challenged Balb/c mice that had been given Venezuelan equine encephalitis (VEE) vector containing the SARS nucleocapsid protein gene [18]. Those challenged animals exhibited infection similar to unvaccinated animals as well as Th2-type immunopathology. A similar experiment with a VEE vector containing only the S gene exhibited protection against infection and no immunopathology. More recently, this group has reported immunopathology with prominent eosinophil infiltration after SARS-CoV challenge in Balb/c mice vaccinated with the same double-inactivated whole virus vaccine used in our experiments [28]. They attribute the immunopathologic reaction following these SARS-CoV vaccinations to presence of the nucleocapsid protein (N) in the vaccine.
In another report, vaccinia was used as a vector vaccine for immunizing Balb/c mice with each of the SARS-CoV structural proteins (N, S, membrane, and envelope) and then challenged with SARS-CoV [21]. Virus infection was present in all groups after challenge but reduced in the S vector vaccine group. Histopathology scores were high for the N containing vector group and low for the S containing group and for the vehicle control group. Eosinophilic infiltrates and IL-5 were increased in the N vaccine group but only IL-5 was increased in the S vaccine group.
To be certain the Th2 type immunopathology was elicited by the S protein vaccine in our studies and in hopes a greater immune response would result from higher dosages of the vaccine and induce greater protection against infection as well as reduce or prevent the immunopathology, our experiment 2 used up to 9 µg of the S protein for immunization. While increased titers of serum antibody were induced and no virus was detected day two after challenge in most animals, the Th2-type immunopathology occurred after challenge, and the immunopathology seen earlier after vaccination with the DI whole virus vaccine was seen again. This experiment also included the whole virus vaccine tested earlier in ferrets and nonhuman primates where the Th2-type immunopathology was initially seen. That vaccine, the BPV in this report, exhibited a pattern of antibody response, protection against infection and occurrence of immunopathology after challenge similar to the DI whole virus vaccine (DIV).
A final experiment was conducted to evaluate specificity. The Balb/c mouse was compared to C57BL/6 mice which do not exhibit the Th2 response bias known to occur in Balb/c mice. C57BL/6 mice in that same experiment exhibited results on challenge similar to those seen in Balb/c mice. Challenge of animals given prior influenza vaccine were infected and exhibited histopathologic damage similar to animals given PBS earlier; neither group exhibited the eosinophil infiltrations seen in animals given a SARS-CoV vaccine.
In these various experiments alum was used as an adjuvant and this adjuvant is known to promote a Th2 type bias to immune responses [48]. However, the immunopathology seen in vaccinated-challenged animals also occurred in animals given vaccine without alum. In an effort to determine whether an adjuvant that induced a bias for a Th1-type response would protect and prevent the immunopathology, we initiated an experiment where the DI PBS suspended vaccine was adjuvanted with Freund's complete adjuvant, a Th1-type adjuvant. However, this experiment was aborted by the September, 2008, Hurricane Ike induced flood of Galveston, Texas. An experiment with a SARS-CoV whole virus vaccine with and without GlaxoSmithKline (GSK) adjuvant ASO1 in hamsters has been reported [25]. This adjuvant is thought to induce Th1-type immune responses [49]. The authors indicate no lung immunopathology was seen among animals after challenge, including the group given vaccine without adjuvant; however, whether the hamster model could develop a Th2-type immunopathology is uncertain. Finally, a number of other studies of vaccines in animal model systems have been reported but presence or absence of immunopathology after challenge was not reported.
A summary of the SARS-CoV vaccine evaluations in animal models (including the current report) that indicated an evaluation for immunopathology after challenge is presented in Table 2. As noted all vaccines containing S protein induced protection against infection while the studies with VEE and vaccinia vector containing the N protein gene only did not. Also shown is that a Th2-type immunopathology was seen after challenge of all vaccinated animals when evaluation for immunopathology was reported except the study in hamsters with a GSK whole virus vaccine. Thus, inactivated whole virus vaccines whether inactivated with formalin or beta propiolactone and whether given with our without alum adjuvant exhibited a Th2-type immunopathologic in lungs after challenge. As indicated, two reports attributed the immunopathology to presence of the N protein in the vaccine; however, we found the same immunopathologic reaction in animals given S protein vaccine only, although it appeared to be of lesser intensity. Thus, a Th2-type immunopathologic reaction on challenge of vaccinated animals has occurred in three of four animal models (not in hamsters) including two different inbred mouse strains with four different types of SARS-CoV vaccines with and without alum adjuvant. An inactivated vaccine preparation that does not induce this result in mice, ferrets and nonhuman primates has not been reported.
This combined experience provides concern for trials with SARS-CoV vaccines in humans. Clinical trials with SARS coronavirus vaccines have been conducted and reported to induce antibody responses and to be “safe” [29], [30]. However, the evidence for safety is for a short period of observation. The concern arising from the present report is for an immunopathologic reaction occurring among vaccinated individuals on exposure to infectious SARS-CoV, the basis for developing a vaccine for SARS. Additional safety concerns relate to effectiveness and safety against antigenic variants of SARS-CoV and for safety of vaccinated persons exposed to other coronaviruses, particularly those of the type 2 group. Our study with a VLP SARS vaccine contained the N protein of mouse hepatitis virus and Bolles, et al., reported the immunopathology in mice occurs for heterologous Gp2b CoV vaccines after challenge [25]. This concern emanates from the proposal that the N protein may be the dominant antigen provoking the immunopathologic reaction.
Because of well documented severity of the respiratory disease among infants given an inactivated RSV vaccine and subsequently infected with RSV that is considered to be attributable to a Th2-type immunopathologic reaction and a large number of studies in the Balb/c mouse model that have described and elucidated many components of the immunopathologic reaction to RSV vaccines, the similarity to the SARS-CoV vaccine evaluations in Balb/c mice supports caution for clinical vaccine trials with SARS-CoV vaccines in humans. Of interest are the similar occurrences in C57BL/6 mice and in ferrets and nonhuman primates that provide alternative models for elucidating vaccine-induced mechanisms for occurrences of Th2 immunopathologic reactions after infection. As indicated, strong animal model evidence indicates expression of the N protein by SARS-CoV vector vaccines can induce sensitization leading to a Th2–type immunopathology with infection. In contrast to our results, those studies did not find clear evidence of the Th2 type immunopathology on challenge of mice given a vector vaccine for the S protein. The finding of a Th-2-type pathology in our studies in animals immunized with an rDNA-produced S protein is unequivocal. In this regard, animal model studies with FIPV in cats and RSV in mice have indicated that viral surface proteins may be the sensitizing protein of inactivated vaccines for immunopathology with infection [32], [45]. This suggests that presentation of the S protein in a vector format may direct immune responses in a different way so that sensitization does not occur.
Limitations of the present studies include their performance in mice only and uncertainty of the relevance of rodent models to SARS-CoV vaccines in humans. Additionally, a more intense study for virus replication including quantitative RT-PCR assays might have confirmed the probability that virus replication is required for induction of the immunopathology after vaccination. Evaluations of mechanisms for the immunopathology, including immunoglobulin and cytokine responses to vaccines and tests for antigen-antibody complexes in tissues exhibiting the reaction, could have strengthened the Th2-type immunopathology finding. Finally, a successful study with a Th1-type adjuvant that did not exhibit the Th2 pathology after challenge would have confirmed a Th2 bias to immune responses as well as provide a potential safe vaccination approach for SARS.
Acknowledgments
We thank I. Darlene Kirk, CCRP, for aid in coordinating the study and preparing the manuscript. MBP antibodies were kindly provided by the laboratory of Drs. Jamie and Nancy Lee, Mayo Clinic Arizona; e-mail address:jjlee@mayo.edu
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: RBC CJP C-TT. Performed the experiments: C-TT ES NI-Y PCN TG. Analyzed the data: RLA RBC C-TT. Contributed reagents/materials/analysis tools: RBC C-TT RLA ES. Wrote the paper: RBC C-TT ES.
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