Przedstawiłem wyniki badania nad amantadyną, które to badanie przesądza batalię o ten lek. Bajki rozsiewane przez ministra Niedzielskiego i radę medyczną przy premierze o nieskuteczności amantadyny okazują się kłamstwem. Dalsze działania naszego (nie)rządu w kwestiach szczepienia ludzi eksperymentalnymi szczepionkami mRNA są bezpodstawne ponieważ to badanie udawania, że jest dostępny lek na rynku leczący covid-19. Tym samym wszystkie zapędy segregacyjne nie mają podstaw naukowych ponieważ ta grupa badawcza udowodniła, że da się leczyć covid-19 amantadyną, która jest w aptekach. Teraz należy zarządzać od (nie)rządu dostępności leku amantadyną dla każdej rodziny w Polsce która potrzebuje tego medykamentu. Uważam, że uznawanie ludzi leczących się amantadyną za foliarzy, teoretyków spiskowych i szurów jest przejawem nieuctwa, ignorancji, napędzanej przez faszystowskie zapędy (nie)rządu Morawieckiego.
Informacje o badaniu naukowym opublikowanym w najbardziej uznanym czasopiśmie naukowym przekazał na tweeterze Pan Gen. Grzegorz Gielerak:
"Amantadyna z rekomendacją do leczenia chorych z COVID-19"

Dyrektor Wojskowego Instytutu Medycznego, gen. dyw. prof. dr hab. n. med.

nature.com/articles/s42003-021-02866-9
twitter.com/ggielerak/status/1466367885769592833

Amantadyna ma potencjał w leczeniu COVID-19, ponieważ hamuje znane i nowe kanały jonowe kodowane przez SARS-CoV-2

Amantadyna i inne inhibitory blokują funkcję kanału jonowego białka E SARS-CoV-2
Uprzednio w badaniu powierzchniowego rezonansu plazmonowego wykazano, że amantadyna wiąże się z natywnym transbłonowym regionem α-helikalnym białka E SARS-CoV-1 (ETM) oraz elektrofizjologią, że blokuje przewodnictwo, w którym pośredniczy białko E pełnej długości (aa 1-75). przy niskim mM stężeniu 12 , 14 . Wykazano również, że przy użyciu kalorymetrii izotermicznej miareczkowania wiąże się z natywnym transbłonowym regionem α-helikalnym białka M2 grypy, a metodą elektrofizjologii blokuje białko M2 o pełnej długości (aa 1-98) przy niskim stężeniu μΜ 31 . Co ciekawe, region transbłonowy białka E z SARS-CoV-2 jest w 100% identyczny z regionem SARS-CoV-1. Dlatego postanowiliśmy zbadać, czy amantadyna blokuje białko E z SARS- CoV-1. Dlatego postanowiliśmy zbadać, czy amantadyna blokuje białko E z SARS-CoV-2. Aby ustalić funkcję kanału jonowego, wykorzystaliśmy X. laevissystem ekspresji w oocytach i monitorowano bieżącą aktywność za pomocą konwencjonalnego dwuelektrodowego typu clamp (TEVC). W trakcie naszych badań, zostało opublikowane za pomocą NMR ciała stałego (SSNMR) z ETM z SARS-CoV-2, który zarówno amantadynę i HMA wiążą ETM porów 32 . Ponadto na podstawie testu bakteryjnego 33 sugerowano, że pochodna amantadyny, memantyna, blokuje replikację SARS-CoV-2 . Odkryliśmy, że po ekspresji w oocytach, pełnej długości białko E z SARS-CoV-2 i -1 wykazywało znacznie zwiększoną bieżącą aktywność w porównaniu do kontrolnych oocytów, wskazując na aktywność kanału jonowego (odpowiednio Ryc. 1a i Ryc. uzupełniający 1a ) . Amantadyna skutecznie blokowała aktywność białka E SARS-CoV-2 (77%; p = 0,006, fig. 1b ) i są zgodne z wcześniejszymi danymi 14 również Zablokowane SARS-CoV-1 białka E (66%, p = 0,005, uzupełniający fig. 1b ), 12 , 14 .

Oprócz amantadyny, jako inhibitory wiroporyn opisano kilka innych sprzedawanych i eksperymentalnych leków.
Aby ustalić, czy aktywność kanału jonowego białka E SARS-CoV-2 może być blokowana przez którykolwiek z tych leków, wybraliśmy siedem (rimantadyna, adamantan, HMA, emodyna, ksanten, pironina B i -Y) i monitorowaliśmy aktywność kanału jonowego w obecności 10 µM każdego leku (Fig. 1c-i ). Wśród nich, HMA zablokowany aktywności kanałów jonowych (50%, p = 0,0094, fig. 1e ) zgodne z ustaloną wiązania regionu transbłonowego SARS-CoV-2 białka E 12 , 14 . Podobną blokadę zaobserwowano dla emodyny (60%, p = 0,0011, ryc. 1f ) i ksantenu (80%,p = 0,0007, Fig. 1g ). W przeciwieństwie do tego rymantadyna, adamantan i pironina B i Y nie wpływały na aktywność kanału jonowego (ryc. 1c, d, h, i ). Brak hamowania przez rymantadynę był zaskakujący, biorąc pod uwagę jej wcześniej opisane wiązanie i hamowanie białka E z SARS-CoV-1 34 oraz tożsamość aminokwasów w regionach transbłonowych białka E z SARS-CoV-1 i -2 ( Rys. uzupełniający 2a i b ). Dlatego zbadaliśmy aktywność rymantadyny i trzech innych inhibitorów, adamantanu, HMA i emodyny, na tę wiroporynę i zgodnie z poprzednimi danymi, rymantadyna rzeczywiście blokowała aktywność kanału jonowego SARS-CoV-1 (37%, p = 0,013, Rysunek uzupełniający 1c). Ten sam wzór zaobserwowano dla adamantanu, który również blokował białko E z SARS-CoV-1, ale nie SARS-CoV-2 (odpowiednio Ryc. Uzupełniający 1d i Ryc. 1d ). W przeciwieństwie do tego, HMA i emodyna blokowały kanały jonowe białka E zarówno z SARS-CoV-1, jak i -2 (ryc. uzupełniający 1e if oraz ryc. 1e if ). Aby dokładniej zbadać interakcję leku z SARS-CoV-2 Protein E, zarejestrowaliśmy dane NMR roztworu w micelach i przeprowadziliśmy symulacje dynamiki molekularnej.

Roztwór NMR ujawnia, że amantadyna, HMA i rymantadyna oddziałują inaczej z białkiem E
Białko E tworzy α-helikalną wiązkę transbłonową złożoną z pięciu monomerów białka ), zasugerowano strukturę z domeną transbłonową utworzoną przez 24-resztową α-helisę (aa 14–37) połączoną z pękniętą cytoplazmatyczną α-helisą (aa 42– 64) za pośrednictwem nieustrukturyzowanego linkera. Region transbłonowy białka E (aa 8–38) z SARS-CoV-2, badany za pomocą ssNMR w dwuwarstwach dimirystoilofosfatydylocholiny (DMPC)/dimirystoilofosfatydylo-glicerolu (PDB ID 7K3G 16 . Jednakże, istnieje zmienność sugerowanej długości domeny transbłonowej i nachylenia wiązki α-helikalnej, w zależności od badanego konstruktu białka E (SARS-CoV-1 lub -2), jak również lipidu lub detergentu użytego do rekonstytucji. W badaniu NMR SARS-CoV-1 Protein E (aa 8–65) w micelach dodecylofosfocholiny (DPC) lub lizo-mirystoilofosfatydyloglicerolu (LMPG) (PDB ID 5X29 16) 32) doniesiono, że tworzy transbłonową α-helisę o podobnej długości (aa 14-34), ale z węższymi porami w środku pęczka pentamerycznego. Niedawne badanie NMR pełnej długości białka E (aa 1-75) z SARS-CoV-2 w micelach heksadecylofosfocholiny sugeruje, że po siedmiu nieustrukturyzowanych resztach (aa 1-7) powstaje 36-resztowa domena transbłonowa (aa 8 –43), który jest połączony poprzez nieustrukturyzowany 10-resztowy fragment (aa 44-52) z dziewięcio-resztową cytoplazmatyczną α-helisą (aa 53-61), po której następują ponownie nieustrukturyzowane reszty cytoplazmatyczne (aa 61-75) 35 , 36 . Wcześniej sugerowano, że obszar wiązania amantadyny w białku E obejmuje reszty przezbłonowe, jak również reszty C-końcowe, zgodnie z analizą roztworu NMR dla białka E (aa 8–65) SARS-CoV-1 w micelach16 oraz ssNMR białka E (aa 8–38) SARS-CoV-2 w kompleksie z amantadyną w dwuwarstwach lipidowych 32 . W jednym badaniu wykazano, że HMA, który skutecznie blokował białko E z SARS-CoV-2 i -1 (ryc. 1e i uzupełniający ryc. 1e ), wiąże się z tym samym regionem co amantadyna w białku E z SARS-CoV-1 16 , jednak w innym badaniu wiązanie między aa 6 i 18 zgodnie z roztworem NMR w micelach białka E pełnej długości (aa 1-75) w micelach HPC 36. Aby dalej zbadać specyficzne dla sekwencji efekty amantadyny, rymantadyny i HMA, zastosowaliśmy NMR roztworu białka E SARS-CoV-2 pełnej długości (aa 1-75) w micelach n-heksadecylofosfocholiny (Fos-Choline-16) (przypomnij sobie, że rymantadyna blokowała białko E z SARS-CoV-1, ale nie SARS-CoV-2 (ryc. 1c i ryc. uzupełniający 1c )). Trzy leki dodano w 10-krotnym nadmiarze w porównaniu z Białkiem E, tj. w stężeniach 2 µm. Przypisanie pełnej długości białka E z SARS-CoV-2 w micelach przeprowadzono przy użyciu
standardowej spektroskopii zoptymalizowanej do relaksacji poprzecznej (TROSY) opartej na potrójnych sekwencjach impulsów rezonansowych, aby połączyć trzy typy jąder atomowych, 1 H, 15 N i 13C. TROSY pozwala na badania dużych cząsteczek lub kompleksów. Sekwencje HNCA HNCOCA, HNCO, HNCACO i HNCACB 37 użyto i otrzymaną zadanie zostało zatwierdzone przed ostatnich doniesień o pełnej długości białka E 36 . Przesunięcia chemiczne szkieletu są podobne w regionie transbłonowym i różnią się w pobliżu mutacji Cys na Ala w resztach 40, 43 i 44. Rysunek 2pokazuje heterojądrowe widmo koherencji pojedynczego kwantu, które jest wykorzystywane do określania korelacji pojedynczych wiązań proton-azot oraz oddzielania sygnałów w celu pomiaru zaburzeń przesunięcia chemicznego (CSP) po związaniu liganda z białkiem E dla amantadyny i rymantadyny. Na pozostałości CSP wartości dla (CSP) po związaniu liganda z białkiem E dla amantadyny i rymantadyny. Na pozostałości CSP wartości dla wszystkich trzech związków (HMA, amantadynę i rymantadyna) przedstawiono w uzupełniającej Fig. 3A-C , obliczona według √ ((δ_H 2 + 0,14 * δ_N 2)/2). Zarówno w przypadku amantadyny, jak i HMA, wyizolowane reszty w pobliżu miejsca wiązania N-końca są podobnie zaburzone, szczególnie w przypadku dwóch reszt następujących po reszcie N15 w porach polarnych. W przypadku reszt G10 i S16, CSP występują w spójnym kierunku dla dwóch związków, podczas gdy rezonans V17 porusza się w przeciwnych kierunkach. W przypadku przesunięcia
kierunkach. W przypadku przesunięcia rymantadyny perturbacje są niewielkie dla S16 i V17, ale znaczący CSP obserwuje się w L27. CSP nie mogą być używane do jednoznacznego określenia lokalizacji wiązania, ale często podkreślają miejsce bezpośredniej interakcji. Największe CSP zaobserwowano dla amantadyny i HMA przy resztach 16 i 17, co jest zgodne z pozycjami wiązania sugerowanymi w symulacjach MD (patrz poniżej). Te dwa leki, a zwłaszcza HMA, mogą oddziaływać również z C-końcem regionu przezbłonowego, jak pokazano z CSP dla reszt 40-42, 45-50, 60-70. Ogólnie rzecz biorąc, mniej znaczące CSP wykryto dla rymantadyny, co sugeruje słabszą interakcję z białkiem E.

Symulacje dynamiki molekularnej wspierają zróżnicowane oddziaływanie amantadyny, rymantadyny i HMA z białkiem E
Aby zbadać możliwe profile wiązania leków z białkiem E, przeprowadziliśmy ograniczone symulacje 100 ns-MD amantadyny, rymantadyny i HMA w kompleksie z białkiem E (aa 8–65) (PDB ID 5X29 16 ) w 1-palmitoilo-oleoilu -sn-glicero-fosfocholina (POPC) dwuwarstwa lipidowa (patrz Dodatkowe informacje). Podejście to zostało wybrane, ponieważ nieograniczone symulacje MD eksperymentalnej struktury białka E (PDB ID 5X9 16 ) skutkowały znacznym rozwinięciem białka. Zdecydowaliśmy się użyć eksperymentalnej struktury białka E (aa 8–65) (PDB ID 5X29 16) rozdzielono za pomocą NMR w roztworze, ponieważ zawiera większość reszt obecnych w białku pełnej długości badanym tutaj przez elektrofizjologię i NMR w roztworze w micelach. Zaobserwowaliśmy, że orientacja zewnętrzna amantadyny lub HMA jest stabilna wewnątrz poru białka E (ryc. 3 ) w przeciwieństwie do orientacji wewnętrznej (ryc. uzupełniająca 4a i b). W orientacji na zewnątrz odpowiednio grupa amonowa lub grupa guanidyniowa była zorientowana w kierunku N-końca i tworzyła wiązania wodorowe z amidowym łańcuchem bocznym N15. Grupa adamantylowa lub azepinylowa odpowiednio amantadyny i HMA była zorientowana w kierunku C-końca w kontakcie z łańcuchami bocznymi L18 izobutylu. Ze względu na szerokie pory tej struktury, pozycjonowanie leku było elastyczne, a także czasami przesuwało się głębiej na C-końcu zgodnie z CSP w pozostałościach na C-końcu obserwowanym w naszych i innych 36 badaniach NMR pełnej długości Białko E. Symulacje MD rymantadyny z ograniczeniem 100 ns wewnątrz poru białka E (aa 8–65) wykazały, że lek porusza się między orientacją wewnętrzną i zewnętrzną (ryc. uzupełniający 4c i d) powodując znaczne zaburzenia białka E z wysokim RMSD ~ 5 Å węgla Cα. Wyniki te wskazują na wiązanie się niestabilny rymantadyny prawdopodobnie ze względu na odpychanie pomiędzy lipofilową CHCH 3 addukt rymantadyna, w porównaniu z amantadyną, z otaczającymi polarnych łańcuchach bocznych N15 i T11. Obserwacje te zgadzają się z naszymi wynikami NMR roztworu sugerującymi słabszą interakcję rymantadyny z białkiem E (aa 1-75) w porównaniu z amantadyną lub HMA.

SARS-CoV-2 ORF7b i ORF10 działają jako kanały jonowe
Viroporins zostały zidentyfikowane w wielu wirusów, w niektórych przypadkach więcej niż jednej na wirusa 8 . W poszukiwaniu nowych celów leków wśród kanałów jonowych kodowanych przez wirusy, przyjrzeliśmy się genomowi SARS-CoV-2 i zidentyfikowaliśmy dwie potencjalne nowe wiroporyny; ORF7b i ORF10 (Fig. 4a ). ORF7b jest małe białko składające się z 43 reszt z ~ 85% identyczności sekwencji pomiędzy SARS-CoV-1 i -2 homologów, a białka SARS CoV-2 i BAT koronawirusów RaTG13 podzielić 97% identyczności sekwencji 38 . W SARS-CoV-1 ORF7b został zidentyfikowany jako białko transbłonowe z zewnętrznym N-końcem i cytoplazmatycznym C-końcem 39. Ponadto ORF7b z SARS CoV-2 ostatnio zaproponowano wpasować pentamer i jest zaangażowany w zaburzenia rytmu serca i utraty zapachu poprzez oddziaływania z innymi białkami, 40 . Odkryliśmy homologię sekwencji aminokwasowej rdzenia ORF7b do białka E z SARS-CoV-1 i -2 w regionie konsensusowym zawierającym trzy konserwatywne reszty Phe (ryc. uzupełniająca 2a i b ) wszystkie skierowane w stronę błony lipidowej, wśród których F23 a F26 biorą udział w oddziaływaniach helisa-helisa w wiązce homo-pentamerycznej 32. Ponadto
SARS-CoV-2 ORF7b ma krótki motyw sekwencji aminokwasowej na końcu C przewidywanego regionu transbłonowego, który jest wysoce homologiczny z sekwencją na końcu N regionu transbłonowego białka E zakaźnego wirusa zapalenia żołądka i jelit (rysunek uzupełniający 2a ). Istnieje dodatkowa homologia między SARS-CoV-1 ORF7b i ORF8a na ich C-końcach (rysunek uzupełniający 2b ).

W tym miejscu powinien być rysunek nr 4

SARS-CoV-2 ORF10 jest sugerowanym białkiem o długości 38 aminokwasów, którego gen znajduje się na końcu 3' genomu wirusa. Jest również obecny w Pangolin-CoV (z ~97% identycznością sekwencji) oraz w wersji skróconej w genomach bat-, civit i SARS-CoV-1 30 , 41 , 42 . Te skrócone wersje mają tylko kwasy 29 pierwszych aminokwasów, które pozostawiają przewidywanego regionu transbłonowego nienaruszone, a tym samym potencjalnie białko funkcjonalnie nienaruszona 43 .

Aby zbadać funkcję kanału jonowego ORF7b i ORF10, ponownie zastosowaliśmy system ekspresji w oocytach X. laevis i monitorowaliśmy bieżącą aktywność za pomocą konwencjonalnego TEVC. Po ekspresji w oocytach, ORF7b i ORF10 wykazywały znacząco zwiększoną bieżącą aktywność w tym samym stopniu co białko E w porównaniu z kontrolnymi oocytami, wykazując aktywność obu kanałów jonowych (Fig. 4b ). Zgodnie z wcześniejszymi danymi 17 , białko 3a wyświetlane funkcja kanału jonowego (fig. 4b ). Tak więc SARS-CoV-2 zawiera nie tylko dwie, ale cztery wiroporyny jako przypuszczalne cele leków dla przyszłych terapii. Zainspirowani tym, użyliśmy X. laevis Platforma ekspresji w oocytach do testowania wybranego zestawu związków, które zostały wcześniej ustalone pod kątem ich działania jako inhibitorów kanałów jonowych.

Wszystkie wiroporyny SARS-CoV-2 mogą być hamowane przez co najmniej jeden bloker kanału jonowego
Serię leków testowanych na białku E z SARS-CoV-2 testowano również na wiroporynach, białku 3a, ORF7b i ORF10 przez monitorowanie aktywności kanału jonowego w obecności 10 µM każdego leku (Fig. 5 ). Cztery z nich, rymantadyna, adamantan, pironina B i -Y nie miały wpływu na żadną z trzech wiroporyn, podczas gdy ksanten, emodyna i amantadyna osłabiły co najmniej dwa z trzech kanałów jonowych (ryc. 5 i tabela uzupełniająca 1 ). Obecna aktywność ułatwiona przez białko 3a została umiarkowanie zablokowana przez ksanten (20%, p = 0,011, Ryc. 5a ), podczas gdy ksanten i emodyna zmniejszyły obecną aktywność za pośrednictwem ORF7b o 47% ( p = 0,001) i 79% ( p = 0,0005, odpowiednio (Fig. 5b ). Brak aktywności emodyna na białku 3a zaskoczeniem, ponieważ poprzedni hamowanie homologicznych białek 3a z SARS-CoV-1 34 , które potwierdzone w naszym układzie eksperymentalnym (uzupełniający fig. 5a ). Podobnie, emodyna nie wykazała hamowania ORF10 (rysunek uzupełniający 5c ). Amantadynę testowano również na białku 3a, ORF7b i ORF10, z których tylko oocyty eksprymujące ORF10 były znacząco zmniejszone (zmniejszenie prądu o 61%, p = 0,0002). Ryc. 5a–c, odpowiednio). Podsumowując, amantadyna zablokowała dwa z czterech kanałów jonowych w SARS-CoV-2 (białko E i ORF10), a aktywność wszystkich czterech kanałów jonowych w SARS-CoV-2 była znacząco hamowana przez co najmniej jeden z ośmiu zastosowanych leków.