Hek 293 buněk bylo vytvořeno v roce 1973 transfekcí kultur normálních lidských embryonálních ledvinových buněk s řežoucí DNA adenoviru 5 v laboratoři Alexe van der Eba v Leidenu v Nizozemsku. Buňky byly získány z jediného, přerušeného nebo potrateného plodu, jehož přesný původ je nejasný. [1][2] Buňky byly kultivovány van der Ebem; transdukci adenovirem provedl Frank Graham, post-doc v laboratoři van der Eba. Byly publikovány v roce 1977 poté, co Graham odešel z Leidenu na McMasterovu univerzitu. [3] Nazývají se HEK, protože pocházejí z lidských embryonálních ledvinových kultur, zatímco číslo 293 pochází z Grahamova zvyku číslovat jeho experimenty; původní klon buňky HEK 293 byl z jeho 293. experimentu. Graham provedl transfekci celkem osmkrát a získal pouze jeden klon buněk, které byly kultivovány několik měsíců. Po pravděpodobně přizpůsobení tkáňové kultuře se buňky z tohoto klonu vyvinuly do relativně stabilní linie HEK 293.

Následná analýza ukázala, že transformace byla provedena vložením ~4,5 kilobases z levého ramene virového genomu, který byl začleněn do lidského chromozomu 19. [4]

Po mnoho let se předpokládalo, že buňky HEK 293 byly generovány transformací fibroblastických, endoteliálních nebo epitelových buněk, z nichž všechny jsou hojné v ledvinách. Původní transformace adenoviru však byla neefektivní, což naznačuje, že buňka, která nakonec vytvořila řadu HEK 293, mohla být v určitém stylu neobvyklá. Graham a jeho spolupracovníci poskytli důkazy, že buňky HEK 293 a další lidské buněčné linie generované adenovirovou transformací lidských embryonálních ledvinových buněk mají mnoho vlastností nezralých neuronů, což naznačuje, že adenovirus přednostně transformoval buňku neuronální linie v původní ledvinové kultuře. [5]

Komplexní studie genomů a transkripčních zákulí HEK 293 a pěti odvozených buněčných linií porovnala transkripci HEK 293 s transkripcí lidské ledviny, nadledvinek, hypofýzy a centrální nervové tkáně. [6] Vzor HEK 293 se nejvíce podobal vzoru nadledvinek, které mají mnoho neuronálních vlastností. Vzhledem k umístění nadledvinek (nadledvinky znamená "vedle ledvin"), několik nadledvinek se mohlo věrohodně zjevit v embryonální kultuře odvozené od ledvin a mohlo by být přednostně přeměněno adenovirem. Adenoviry transformují buňky neuronální linie mnohem efektivněji než typické epitelové buňky lidských ledvin. [5] Embryonální prekurzorová buňka nadledvin se proto jeví jako nejpravděpodobnější buňka původu linie HEK 293. V důsledku toho by neměly být buňky HEK 293 používány jako in vitro model typických ledvinových buněk.

Buňky HEK 293 mají komplexní karyotyp, vykazující dvě nebo více kopií každého chromozomu a s modálním chromozomovým číslem 64. Jsou popsány jako hypotriploidní, obsahující méně než trojnásobek počtu chromozomů haploidní lidské gamety. Chromozomální abnormality zahrnují celkem tři kopie chromozomů X a čtyři kopie chromozomu 17 a chromozomu 22. [6][7] Přítomnost více chromozomů X a nedostatek stop po sekvenci odvozené z chromozomu Y naznačují, že zdrojovým plodem byla samice.

Varianty[upravit]

Bylo hlášeno několik variant HEK 293. [citace nutná]

HEK 293F

HEK 293FT

HEK 293T

HEK 293S

HEK 293FTM

HEK 293SG

HEK 293SGGD

HEK 293H

HEK 293E

HEK EBNA1-6E[8]

HEK 293MSR

HEK 293A

Aplikace[upravit]

Imunofluorescenční HEK 293 buněk

Buňky HEK 293 jsou přímočaré pro růst v kultuře a transfekt. Byly použity jako hostitelé pro expresi genů. Tyto experimenty obvykle zahrnují transfekci v genu (nebo kombinaci genů) zájmu a poté analýzu exprimovaného proteinu. Rozšířené používání této buněčné linie je způsobeno její transfekčností různými technikami, včetně metody fosfátů vápenatého, což dosahuje účinnosti blížící se 100%.

Příklady takových experimentů zahrnují:

Účinky léku na sodíkovékanály [9]

Inducible RNA interference system[10]

Isoform-selective protein kinase C agonist[11]

Interaction between two proteins[12]

Nuclear export signal in a protein[13]

HEK 293 cells were adapted to grow in suspension culture, as opposed to proliferation on plastic plates, in 1985.[14] This enabled the growth of large amounts of recombinant adenovirus vectors.

A more specific use of HEK 293 cells is in the propagation of adenoviral vectors.[15] Viruses offer an efficient means of delivering genes into cells, which they evolved to do, and are thus of great use as experimental tools. However, as pathogens, they also present a risk to the experimenter. This danger can be avoided by the use of viruses which lack key genes, and which are thus unable to replicate after entering a cell. In order to propagate such viral vectors, a cell line that expresses the missing genes is required. Since HEK 293 cells express a number of adenoviral genes, they can be used to propagate adenoviral vectors in which these genes (typically, E1 and E3) are deleted, such as AdEasy.[16] However, homologous recombination between the inserted cellular Ad5 sequence and the vector sequence, although rare, can restore the replication capacity to the vector.[17]

An important variant of this cell line is the 293T cell line. It contains the SV40 large T-antigen that allows for episomal replication of transfected plasmids containing the SV40 origin of replication. This allows for amplification of transfected plasmids and extended temporal expression of desired gene products. HEK 293, and especially HEK 293T, cells are commonly used for the production of various retroviral vectors.[18] Various retroviral packaging cell lines are also based on these cells.

Native proteins of interest[edit]

Depending on various conditions, the gene expression of HEK 293 cells may vary. The following proteins of interest (among many others) are commonly found in untreated HEK 293 cells:

Corticotrophin releasing factor type 1 receptor[19]

Sphingosine-1-phosphate receptors EDG1, EDG3 and EDG5[20]

Muscarinic acetylcholine receptor M3[21]

Transient receptor potential TRPC1, TRPC3, TRPC4, TRPC6[22]

Bioethics[edit]

Alvin Wong argues that despite the uncertainty over the origin of the fetus used to obtain the cell line, circumstantial evidence strongly suggests that it came from an elective abortion. In the context of Catholic teaching, this presents ethical difficulties for using HEK 293 and derivative products, such as vaccines.[23][24]

The US Conference of Catholic Bishops, with the document receiving approval from the Pope, have stated that “it is morally acceptable to receive COVID-19 vaccines that have used cell lines from aborted fetuses in their research and production process”, while at the same time calling on governments and vaccine producers to stop using these cell lines.[25]

Pro-life medical ethicists have said that since the cell lines are immortal, receiving the COVID-19 vaccine does not increase demand for abortion.[citation needed]

During the COVID-19 pandemic, anti-vaccination activists noted that HEK 293 cells are used in the manufacturing of the Oxford–AstraZeneca COVID-19 vaccine (AKA AZD1222). The cells are filtered out of the final products.[26][24]

References[edit]

^ van der Eb A. "USA FDA CTR For Biologics Evaluation and Research Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee Meeting" (PDF). Lines 14–22: USFDA. p. 81. Archived from the original(PDF) on 2017-05-16. Retrieved August 11, 2012.

^ Austriaco N (25. května 2020). "Morální pokyny k používání vakcín COVID-19 vyvinuté s lidskými buněčnými liniemi plodu". Veřejná rozprava. Witherspoonův institut. Načteno 23. prosince 2020. Před pár měsíci jsem dostal e-mail od profesora Franka Grahama, který založil tuto linku. Řekl mi, že podle jeho nejlepšího vědomí je přesný původ fetálních buněk HEK293 nejasný. Mohly pocházet buď ze spontánního potratu, nebo z volitelného potratu. Bez ohledu na potraty, které daly vzniknout třem buněčných liniím - nebo v případě HEK293 potratu - se staly před desítkami let.

^ Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R (červenec 1977). "Charakteristiky lidské buněčné linie transformované DNA z lidského adenoviru typu 5". Časopis všeobecné virologie. 36 (1): 59–74. CiteSeerX10.1.1.486.3027. doi:10.1099/0022-1317-36-1-59. PMID 886304. [trvalé mrtvé spojení]

^ Louis N, Evelegh C, Graham FL (červenec 1997). "Klonování a sekvenování buněčno-virových spojů z lidského adenoviru typu 5 transformovala 293 buněčnou linii". Virologie. 233 (2): 423–9. doi:10.1006/viro.1997.8597. PMID 9217065.

^ Vyskočte na:a B Shaw G, Morse S, Ararat M, Graham FL (červen 2002). "Preferenční transformace lidských neuronálních buněk lidskými adenoviry a původ buněk HEK 293". Deník FASEB. 16 (8): 869–71. doi:10.1096/fj.01-0995fje. PMID 11967234. S2CID 6519203.

^ Vyskočte na:a B